Hmotnostní spektrometrie

Hmotnostní spektrometrie je fyzikálně-chemická metoda, která stanovuje hmotnosti molekul a atomů po jejich převedení na ionty. Podstatou hmotnostní spektrometrie je separace iontů produkovaných v iontovém zdroji přístroje na základě jejich efektivní hmotnosti (m/z, kde m-hmotnost iontu a z-nábojové číslo) a jejich následná detekce. Všechny tyto procesy probíhají v uzavřeném prostoru, ve kterém je pomocí systému pump kontinuálně udržováno vákuum.

Hmotnostní spektrometr je složen z těchto částí:

  • iontový zdroj
  • hmotnostní analyzátor
  • detektor
  • počítačová jednotka

K produkci iontů (ionizaci) se v hmotnostní spektrometrii používá několik způsobů:

  • ionizace elektronovým paprskem (EI)
  • chemická ionizace (CI)
  • ionizace rychlými atomy a ionty (FAB, fast atom bombardment)
  • působením elektrostatického pole (FI-field ionisation, FD-field desorption)
  • desorpce plasmou (PD)
  • desorpce laserem za přítomnosti matrice (MALDI-matrix-assisted laser desorption/ionization) / pevných částic (SALDI)
  • ionizace elektrosprejem (ESI) / termosprejem (TSI)

Hmotnostní analyzátory umožňují v čase a/nebo v prostoru separaci směsi iontů o různých hmotnostech. Rozlišujeme několik druhů hmotnostních analyzátorů:

  • kvadrupolový analyzátor (je tvořený čtyřmi paralelními kovovými tyčemi uspořádanými symetricky vzhledem k trajektorii procházejících iontů, které jsou vzájemně elektricky propojeny, přičemž ionty produkované v iontovém zdroji jsou postupně propoušteny přes kvadrupol změnou velikosti napětí)
  • ion-cyklotronová rezonance (ICR, ionty se pohybují po uzavřených kruhových drahách, kde jsou vystavené homogennímu magnetickému poli)
  • iontová past (funkční obdoba kvadrupolových analyzátorů s uzavřeným elektrostatickým polem)
  • průletové analyzátory (TOF, ionty jsou z iontového zdroje akcelerovány napětím a stanovuje se doba průletu iontu letovou trubicí k detektoru)

Detektory pak následně poskytují signál úměrný počtu dopadajících iontů, buď detekcí elektrického proudu, vznikajícího přímým dopadem iontů a nebo pomocí elektronového násobiče pracujícího na principu sekundární emise elektronů, kde dochází k zesilování primárního signálu.
Výsledkem metody je záznam iontů zkoumaného vzorku, tzv. hmotnostní spektrum, na kterém je v závislosti na hodnotě m/z zobrazeno zastoupení jednotlivých iontů.


MALDI (matrix-assisted laser desorption / ionization)

Princip: vzorek je po smíchání s matricí vykrystalizován  na MALDI destičce (odpaření) a následně je ozářen pulsním laserem (kdy dochází k ionizaci molekul matrice, molekuly vzorku jsou ionizovány přenosem protonu z matrice). Matrice chrání vzorek před rozpadem, napomáhá odpaření a ionizaci vzorku. (např.:CHCA, DHB)
Měření probíhá buď v lineárním módu (přímá dráha letu, měření proteinů) a nebo v reflektronovém módu (prodloužení dráhy letu za pomoci reflekronového iontového zrcadla, měření peptidů).

TOF analyzátor: rychlosti průletů jednotlivých iontů letovou trubicí jsou závislé na hodnotách jejich efektivních hmotností m/z.

Využití:

Metody hmotnostní spektrometrie patří k nejdokonalejším a nejmodernějším analytickým metodám vůbec. Umožnují nejen kvantitativní a kvalitativní analýzu, ale i analýzu izotopického složení jednotlivých prvků, ze kterých je vzorek složen.
Hmotnostní spektrometrie je metoda všestranná a vysoce senzitivní a její využití má budoucnost především pro identifikaci proteinů a peptidů a stanovování proteinových profilů jak v biologii, tak i v medicíně.
V lékařských oborech je diagnostický proteomický přístup krokem pro časnou detekci nádorových onemocnění a v nalezení nových prognostických a prediktivních markerů, ale své uplatnění má i při studiu genetických onemocnění, v screeningu vrozených metabolických poruch a k detekci metabolitů, které mohou sloužit jako markery pro diferenciální diagnostiku metabolických onemocnění.
Hmotnostní spektrometrie má však své využití i v oblasti přírodních věd, kde má své uplatnění při studiu rostlinných a živočišních genomů.


Literatura:

  1. Základy hmotnostní spektrometrie, Hernychová L., Fakulta vojenského zdravotnictví, Universita obrany, Hradec Králové
  2. Mass spectrometry- based proteomics, Aebersold R., Mann M., Nature 2003, March 13; 422(6928)
  3. Proteomic database for storage analysis, presentation and retrieval information from mass spectrometry experiments, Allmer J., BMC Bioinformatics 2008 July 7
  4. MALDI/MS peptide mass fingerprinting for proeteome analysis, Gonnet F., Proteome science 2003
 

 

oponenti intranet