Imunofenotypizace pomocí průtokové cytometrie

Cílem imunofenotypizace je charakterizovat leukocyty či jiné buňky na základě jejich antigenních a jiných znaků.
Princip stanovení povrchových nebo jiných intracelulárních znaků je založený na vazbě sledovaného znaku a protilátky, která je značena fluorescenční koncovkou v případě přímé imunofluorescence. Pokud je primární protilátka neznačená, vyžaduje vizualizaci protilátkou sekundární, která je zančená fluorescenční koncovkou, která je vhodná pro analýzu průtokovou cytometrií. V případě intracelulárních znaků je nezbytné provést fixaci a permeabilizaci buněčné nebo jaderné membrány tak, aby byla prostupná pro zvolené protilátky. Po vazbě protilátky na protein je možné provést fixaci komplexu protein protilátka ke zvýšení stability komplexu. Fixačních postupů je celá řada, často pro různé molekuly je doporučována různě optimalizovaná metoda, vzhledem k faktu, že každá fixace více či méně mění konformaci a tím i dostupnost molekuly vůči protilátce.
Pokud jako materiál používáme vzorky, které obsahují velké množství erytrocytů je žádoucí je odstranit lýzou hypotonickým roztokem, tak aby svým množstvím nekomplikovaly výslednou analýzu.

Jako základní protokol používáme kit od Becton Dickinson Bioscence, Simulset IMK lymphocyte Kit. V tomto kitu používaná sestava protilátek je základním doporučeným panelem pro imunomonitoring (CDC-panel) od American Center for Disease Control.‚ (T (CD3+) lymfocyty, B (CD19+) lymfocyty, helpery/inducery T (CD3+CD4+) lymfocyty, supresory/cytotoxické T (CD3+CD8+) lymfocyty a přirození zabíječi (NK) (CD3-CD16+ a/nebo CD56+) lymfocyty). Samozřejmě je možné značit vzorky dalšími monoklonálními protilátkami dle požadavků experimentu.

 

 

oponenti intranet