Real-time RT PCR (kvantitativní PCR v reálném čase)
Detekce minimální reziduální choroby s využitím PCR metody znamená studium genové exprese. Naším cílem je detekovat hledaný znak nádorových epiteliálních buněk na úrovni RNA sekvence (informační RNA – mRNA). K tomu účelu využíváme metodu reverzní transkripce (RT). Pomocí ní je izolovaná RNA přepsána do komplementární DNA (cDNA) a ta se pak použije jako templát pro PCR reakci. Real-time RT-PCR je metoda umožňující přesnou kvantifikaci hledané cDNA sekvence ve vzorku. Využívá se zde několika možností detekce narůstajícího množství amplikonů. Všechny jsou založeny na nárůstu fluorescence. Principiálně nejjednodušší je metoda využívající fluorescenčních barviv, která se interkalují mezi báze DNA (např. Sybr Green), narůstající fluorescence pak odpovídá vzrůstajícímu množství DNA ve vzorku. V současnosti je asi nejvíce rozšířená metoda využívající 5-exonukleázové aktivity DNA polymerázy. Klíčovým je zde použití oligonukleotidu – próby (nejčastěji TaqMan sonda), která se specificky váže na sekvenci mezi oběma primery. Sonda je na jednom svém konci označena fluorescenční látkou a na druhém konci zhášečem fluorochromu. Při syntéze komplementárních vláken hydrolyzuje DNA polymeráza TaqMan sondu, dojde k uvolnění fluorescenční látky a k nárůstu fluorescence, která je detekována a zaznamenána v reálném čase. Na základě standardizačních křivek lze přesně kvantifikovat množství hledané cDNA sekvence (našeho markeru) ve vzorku.
Reverzní transkripce prováděná na MJR termal cycler PTC 100.