Proteomické pracoviště

Vedoucí pracovník: MUDr. Petr Džubák, Ph.D.

Proteom je základní charakteristikou buňky a jeho studium je klíčové pro pochopení řídících a regulačních mechanismů. Jednotlivé proteiny se v buňce vyskytují v širokém dynamickém rozsahu, které jsou často unikátní díky postranslačním modifikacím. Eukaryontní buňka obsahuje až několik desítek tisíc různých proteinů v dynamickém rozsahu až pěti řádů. Díky rozvoji technologií hmotnostní spektrometrie a jejich využití v proteomice teprve v několika posledních letech bylo umožněno reálně kvantifikovat a analyzovat komplexní proteom buňky.

Analýza proteomu je v principu založena na kombinaci separační metody (jako je 2D, 1D, HPLC)  a následné hmotnostně spektrometrické analýzy (viz odkaz principy hmotnostní spektrometrie) pro stanovení  molekulových hmotnostní proteinů a peptidů vzniklých jejich štěpením proteolytickými enzymy. Získaná data jsou porovnávána s veřejně dostupnými údaji v databázích, na jejichž základu je provedena identifikace jednotlivých proteinů.

Po naznačení proteinů (in vivo, in vitro) pomocí těžkých aminokyselin je možné využít proteomické technologie nejen ke kvalitativní analýze, ale i ke kvantitativnímu stanovení jednotlivých proteinů.

Klíčovým parametrem ovlivňujícím identifikace proteinů je přesnost hmotnostního spektrometru.

Proteomické pracoviště při Laboratoři experimentální  medicíny je vybaveno hmotnostně spektrometrickým analyzátorem doby letu ve spojení s technikou MALDI (Autoflex III TOF/TOF, Bruker) a vysoce kapacitní iontovou pastí umožňující disociační techniky (Esquire HCT-ETD/PTM, Bruker). Jako separační techniky používáme 1D, 2D, kapalinovou chromatografii (Agilent 1200) ve spojení s MALDI a elektrosprejem (ESI). Pro spojení kapalinové chromatografie s MALDI (LC-MALDI) máme spotovací zařízení Proteineer fc (Bruker). Pro analýzu naměřených spekter využívame databázový a analytický software Proteinscape 2.0 (Bruker) ve spojení s databázemi proteinů Mascot (http://www.matrixscience.com ) a Phenyx (http://phenyx.vital-it.ch ).

Na našem pracovišti řešíme:

• Problematiku analýzy proteomu nádorových buněk a to ve smyslu klasifikace účinku protinádorových léčiv na úrovni sledování expresních profilů in vitro/in vivo.
• Hledání nových terapeutických cílů.
• Klasifikace mechanismů nádorové rezistence sledováním proteomických expresních profilů senzitivních versus rezistentních nádorů, identifikace genů/proteinů asociujících s rezistencí tumoru na terapii, hledání nových cílů pro chemosensitizační léčbu.

Obr. 1. Spojení kapalinové chromatografie s ESI-MS/MS a spotovacím zařízením pro MALDI.

Obr. 2. Spotovací zařízení  pro LC-MALDI (Proteineer fc, Bruker) 

Obr.3. MALDI – TOF/TOF (Autoflex III, Bruker)