Pracoviště průtokové cytometrie

Vedoucí pracovník: MUDr. Petr Džubák, Ph.D.

Základem přístrojového vybavení cytometrického pracoviště je průtokový cytometr FACSCalibur vybavený jedním laserem o vlnové délce 488nm. Přístroj je schopný měřit pět parametrů: FCS (relativní velikost částic), SCS (rozptýlené nebo odražené světlo pod úhlem 90°,  tento parametr je indikátorem granularity a/nebo nepravidelnosti buněk a současně tři fluorescenční parametry hodnotící fluorescenci částice (buňky), excitovanou laserovým paprskem. Detekce je limitována v uvedeném rozsahu vlnových délek na základě optické výbavy přístroje (detektory FL1-530/30 BP, FL2 – 585/42 BP, FL3 – 650 LP).
Vyhodnocení dat probíhá na pracovní stanici PowerMac G4. 

Programové vybavení:

• CELLQuest (základní ovládací a analytický software průtokového cytometru)
• ModFit LT (analýza buněčného cyklu, ploidity)
• FACSComp (automatické nastavení kompenzace) 
• SimulSET  (analýza subpopulací lymfocytů, imunofenotypizace)

V roce 2008 byl z Finančního mechanismu EHP/Norsko pořízen Vysokorychlostní sorter FACS ARIA II SORP.

Základní parametry tohoto přístroje jsou:

1. Čtyři vzduchem chlazené lasery s excitací 488nm, 445nm, 6635nm a 355nm.
2. Možnost měření všemi čtyřmi dodanými lasery současně.
3. Reflexní optika s vysokou citlivostí, systém rozvodů pomocí optických vláken bez nutnosti kalibrace a seřizování laserů.
4. Rychlost sortování až do 70 000 částic/sec.
5. Zařízení zabezpečující automatickou ochranou již vytříděných částic při jakékoliv nestabilitě systému.
6. Automatický sběr sortovaných částic do zkumavek a vícejamkových destiček, mikroskopických skel při zachování sterility produktu.
   

Pracoviště průtokové cytometrie řeší několik stěžejních témat:

1. Testování nových sloučenin s potenciálním protinádorovým účinkem (analýza cytotoxicity a změn buněčného cyklu, analýza molekulárně biologických mechanismů  účinku)
2. Vznik a možnosti ovlivnění mnohočetné lékové rezistence (analýza a možnosti ovlivnění MDR fenotypu)
3. Možnosti predikce a prognózování nádorového onemocnění (proliferační index, ploidita, apoptotický index, pozitivita nádoru v BrdU značení ex vivo, vyšetření MDR fenotypu a podobně)

Zavedené metodiky:

• vyšetření buněčného DNA obsahu metodami průtokové cytometrie (buněčný cyklus, ploidita možnost retrospektivní analýzy archivní deparafinizované nádorové tkáně) - akreditovaná metoda
• vyšetření exprese antigenů a ověření kvality protilátek metodou průtokové cytometrie (imunofenotypizace lymfocytů periferní krve pomocí kitu IMK – lymphocyte kit, exprese P-glykoproteinu) - akreditovaná metoda
• analýza buněčné proliferace (pulzní značení BrdU, in vitro, ex vivo nebo in vivo, značení pH3Ser10)
• analýza apoptózy: stanovení hypodiploidního píku po eluci fragmentované DNA hypotonickým citrátovým pufrem,  barvení anexinem V, značení DNA zlomů terminální nukleotidtransferázou (TUNEL assay)
• multiparametrická analýza exprese proteinů buněčného cyklu (simultánní značení propidium iodidem a cykliny, panD, D1, A, B1)
• analýza exprese proteinů mnohočetné lékové rezistence MDR (MRP, LRP, topoizomeráza IIa)
• funkční analýza MDR fenotypu (efluxní testy, inhibice transportu MDR modelovými inhibitory)
• hodnocení mitochondriálního poškození (mitochondriální swelling (calceinová metoda), mitochondriální potenciál (JC-1), tvorba kyslíkatých radikálů (dihydroethidium)
• stanovení pH fagosomu

Zpracováváme: nádorové i nenádorové buněčné linie, čerstvou nefixovanou nádorovou tkáň, periferní krev, kostní dřeň, archivní fixovaný parafinizovaný materiál. Požadavky na konkrétní vyšetření je potřeba domluvit separátně.